Hablamos sobre las nuevas perspectivas en Biomarcadores Tumorales y Proteómica con Josep Villanueva responsable del grupo de Biomarcadores Tumorales del Vall d’Hebron Institut d’ Oncologia (VHIO):
Vuestro último trabajo publicado en Molecular & Cellular Proteomics sobre el papel de la secreción no convencional de proteínas en el secretoma de las células tumorales está despertando gran expectación entre la comunidad científica. ¿a qué se debe?
Josep Villanueva: Ya sabemos, desde hace algunos años, que el microambiente que se encuentra inmediatamente en contacto con las células cada vez cobra más importancia en la búsqueda de biomarcadores que indiquen qué les sucede a estas células. Todo parece indicar que, en este microambiente o microecosistema, se acumulan proteínas secretadas por las células que traducen los procesos que le suceden a las mismas – lo que se llama secretoma. Este secretoma no sólo juega un papel importante en la comunicación entre células tumorales y células del estroma sino que parte de este secretoma puede llegar al torrente sanguíneo.
Nuestro grupo en el VHIO cree, en la misma línea que otros grupos, que el secretoma cobra especial importancia en el caso de las células tumorales en las que se sitúa a este “espacio” extracelular como una fuente de potenciales biomarcadores tumorales y dianas terapéuticas. Nuestro trabajo ha ahondado en la importancia de estas proteínas encontradas alrededor de la célula tumoral como biomarcadores de la actividad de estas células, pero sobre todo hemos resuelto dos problemas metodológicos que hasta ahora limitaban el estudio del secretoma del cáncer y su uso. Esta publicación marca una diferencia metodológica para futuros estudios, pues hemos descrito la situación de partida para la detección de todas estas proteínas y hemos establecido cómo determinar las que no son válidas para el estudio.
¿No todas las proteínas son útiles?
Josep Villanueva: No. De hecho, a pesar de que muchos expertos creen que el secretoma puede tener la clave de muchos procesos celulares, la gran cantidad de interferencias en su estudio ha dificultado, hasta el momento, resultados claros en esta dirección.
¿Cuáles son estas interferencias en la identificación de las proteínas candidatas a biomarcadores tumorales?
Josep Villanueva: El gran factor limitante y problema hasta la fecha es que de igual forma que en este “espacio” alrededor de la célula se pueden acumular proteínas de gran valor informativo indicadoras de procesos tumorales, debido a la metodología que se usa para aislar el secretoma, también se acumulan gran cantidad de proteínas contaminantes. Aunque el secretoma es un sub-proteoma con claras implicaciones como herramienta diagnóstica para el cáncer, hasta ahora había dos problemas metodológicos que limitaban su uso eficaz. El primero es que el secretoma generado por las células tumorales tiene una contribución importante de proteínas asociadas a procesos de muerte celular. El segundo es que deberíamos ser capaces de diferenciar las proteínas secretadas de las proteínas del medio, dado que el medio en el que crecen las células también tiene proteínas.
Este problema, ¿lo habéis resuelto en vuestro estudio?
Josep Villanueva: En nuestro estudio, lo primero que determinamos fue cómo identificar las proteínas halladas en el secretoma que miden estos procesos de muerte celular, que son las que pueden producir más interferencias. Luego seguimos con aquellas proteínas fruto de la contaminación de este secretoma con las propias proteínas que se hallan en el suero que se usa para el cultivo de las células tumorales y hemos descartado los artefactos conocidos hasta llegar y aislar al verdadero secretoma generado por las células tumorales.
¿Cómo habéis evitado estos artefactos en el estudio?
Josep Villanueva: En el trabajo que hemos publicado recientemente hemos solucionado estos dos problemas mediante estudios cinéticos de secreción de proteínas, marcaje de células con isotopos estables (no radioactivos) y el uso de la espectrometría de masas.
Y…¿habéis logrado identificar proteínas más allá de estos “contaminantes”?
Josep Villanueva: Efectivamente. Al solucionar los principales problemas metodológicos para el estudio de los secretomas, nos hemos encontrado con que aproximadamente la mitad de las proteínas secretadas por células tumorales no son secretadas por la vía clásica, es decir, mediante un péptido señal. Este grupo de proteínas tiene una localización teórica en el interior de la célula, por ejemplo, en el núcleo, mitocondria, citoplasma,… y muchas de ellas nunca se habían encontrado de una manera específica fuera de la célula.
¿Entonces, es la primera vez que se confirman estos hallazgos?
Josep Villanueva: Sí, nunca se había diseccionado de una manera global el secretoma estudiando las distintas vías de secreción. Ha habido grupos de investigación que han descubierto que una proteína concreta se secretaba por vías alternativas pero nosotros hemos demostrado que este fenómeno está muy extendido. La presencia de tantas proteínas secretadas por vías alternativas, que no se esperaba encontrar de una manera específica en el espacio extracelular, abre posibilidades inesperadas con descubrimientos como que algunas de estas proteínas tengan funciones distintas en los distintos compartimentos celulares en los que se encuentran.
Comentas que un gran número de proteínas son secretadas por vías alternativas. ¿Cómo se secretan las proteínas normalmente?
Josep Villanueva: Las proteínas secretadas por la via clásica lo hacen mediante la vía del Retículo Endoplasmático y el aparato de Golgi, utilizando el péptido señal. Entre las vías alternativas tenemos los exosomas y las microvesículas. Otras proteínas secretan sus dominios extracelulares por procesos de shedding, es decir, que una proteasa corta específicamente una parte de la proteína que queda fuera de la célula, mientras que otra parte permanece dentro. Además, es importante resaltar que todavía hay vías de secreción alternativa que no se conocen.
Lo que hemos encontrado es que aproximadamente la mitad de las proteínas secretadas por células tumorales no son secretadas por la vía clásica, es decir, mediante un péptido señal, sino por esas vías no clásicas o alternativas. Esta secreción alternativa, precisamente, no actúa como respuesta a “lo esperable” sino como traducción de un proceso anómalo, de ahí su valor informativo sobre el proceso patológico. Son proteínas cuya localización no debería ser extracelular, pero ante un proceso tumoral lo es y eso es lo que las hace valiosas como candidatas a biomarcadores tumorales.
Y, metodológicamente ¿es muy complejo el estudio proteómico del secretoma?
Josep Villanueva: Tiene una elevada complejidad. Las técnicas proteómicas cobran cada día más importancia. Esto hace que hoy sean posibles estudios que ayer no lo eran y que podamos diseñar estudios que hoy no son viables pero mañana lo serán. La proteómica presenta limitaciones frente a otras disciplinas, como por ejemplo la genómica. La propia determinación de qué es lo medible forma parte de la primera tarea a llevar a cabo, pues a diferencia de otras técnicas, en la proteómica no existen todavía estándares determinados por las propias marcas comerciales de los productos y tecnologías usadas. No hay referencias tan buenas como existen en genómica y en estudios de la expresión génica. Y ante cualquier estudio, la primera parte siempre consiste en medir qué vamos medir. En otras disciplinas ya hay unos parámetros establecidos previamente con los que comparar tus resultados.
Desde el punto de vista metodológico ¿qué supone este estudio?
Josep Villanueva: Esta investigación, a parte de los propios resultados que hemos hallado, ha establecido los márgenes metodológicos de estudio del secretoma. La secreción de proteínas, según nuestros experimentos, tiene la particularidad de que es dependiente del tiempo. Los hallazgos de nuestro trabajo han determinado los tiempos óptimos para la recogida del secretoma, balance entre tiempo necesario para la adecuada secreción de proteínas antes de la aparición de contaminantes procedentes de la muerte celular o de la privación de suero (fuente de alimento para la célula), pues se someten las células a lavados para evitar interferencias con las propias proteínas del suero.
Parte de nuestra investigación, ha validado previamente los grupos de proteínas procedentes de situaciones de muerte y estrés celular y, también ha identificado qué proteínas podrían ser consideradas válidas para el control de calidad de líneas celulares de cáncer de mama para posteriores trabajos y análisis de secretoma.
¿Y desde el punto de vista de la investigación del cáncer?
Josep Villanueva: Bien, una vez que demostramos que tantas proteínas se secretan por vías alternativas hicimos una validación funcional de nuestro hallazgo “in vivo”. Seleccionamos un grupo de proteínas de nuestro secretoma que, en realidad, deberían estar en el núcleo y miramos su localización en tejido humano de mama. Para nuestra sorpresa vimos que mientras que en tejido normal estas proteínas son nucleares, en tejido tumoral cambian su localización y esta nueva localización sería compatible con el hecho que se secreten.
Por tanto, este estudio pone de manifiesto que un gran número de proteínas que nunca se habían encontrada en el espacio extracelular, son secretadas específicamente y podrían usarse como marcadores tumorales. Finalmente, planteamos la hipótesis de que las células tumorales utilizan la secreción, no convencional o alternativa, de proteínas durante la formación de un tumor o incluso podría ser un mecanismo usado por las células tumorales durante la tumorogénesis.
Y ahora que metodológicamente habéis logrado solucionar limitaciones de estudio del secretoma, ¿estáis trabajando en biomarcadores concretos?
Josep Villanueva: Al margen de este trabajo en Molecular & Cellular Proteomics estamos trabajando en la caracterización de proteínas que las células de cáncer colorrectal utilizan para comunicarse cuando se estimula una vía llamada EGFR o cuando esta vía se bloquea con nuevos fármacos anti-EGFR. Este proyecto lo realizamos dentro de un proyecto FP7 de la Unión Europea en colaboración con varios grupos internacionales y localmente con el Dr. Josep Tabernero, Director del VHIO. El objetivo de este proyecto es desarrollar nuevos biomarcadores de respuesta a estos fármacos y también conocer los mecanismos de resistencia para sortearlos. También estamos implementando algoritmos que mejoran los resultados obtenidos gracias a la proteómica cuantitativa y, que a su vez, ayudarán a descubrir otros biomarcadores tumorales.
Esperamos poder compartir los resultados próximamente.
