Parlem sobre les noves perspectives en Biomarcadors Tumorals i Proteòmica amb Josep Villanueva responsable del grup de biomarcadors Tumorals de la Vall d’Hebron Institut d’Oncologia (VHIO):
El vostre últim treball publicat a Molecular & Cellular Proteomics sobre el paper de la secreció no convencional de proteïnes en el secretoma de les cèl•lules tumorals està despertant gran expectació entre la comunitat científica. ¿A què es pot atribuir?
Josep Villanueva: Ja sabem, des de fa alguns anys, que el microambient que es troba immediatament en contacte amb les cèl•lules cada vegada cobra més importància en la recerca de biomarcadors que indiquin què els passa a aquestes cèl•lules. Tot fa pensar que, en aquest microambient o microecosistema, s’acumulen proteïnes secretades per les cèl•lules que tradueixen els processos que els hi li succeeixen – el que s’anomena secretoma. Aquest secretoma no només juga un paper important en la comunicació entre les cèl•lules tumorals i les cèl•lules de l’estroma sinó que part d’aquest secretoma pot arribar al torrent sanguini.
El nostre grup al VHIO creu, en la mateixa línia que altres grups, que aquest “espai” extracel•lular -el secretoma-, en el cas de les cèl•lules tumorals, té molta importancia com a font de potencials biomarcadors tumorals i dianes terapèutiques. El nostre treball ha aprofundit en la importància d’aquestes proteïnes trobades al voltant de la cè•lula tumoral com a biomarcadors de l’activitat d’aquestes cèl•lules, però sobretot hem resolt dos problemes metodològics que fins ara limitaven l’estudi del secretoma del càncer i el seu ús. Aquesta publicació marca una diferència metodològica per a futurs estudis, ja que hem descrit la situació de punt de partida per a la detecció de totes aquestes proteïnes i com determinar les que no són vàlides per a l’estudi.
No totes les proteïnes són útils?
Josep Villanueva: No. De fet, tot i que molts experts creuen que el secretoma pot tenir la clau de molts processos cel•lulars, la gran quantitat d’interferències en el seu estudi ha dificultat, fins el moment, resultats clars en aquesta direcció.
Quines són aquestes interferències en la identificació de les proteïnes candidates a biomarcadors tumorals?
Josep Villanueva: El gran factor limitant i problema fins ara és que de la mateixa manera que en aquest “espai” al voltant de la cèl•lula es poden acumular proteïnes de gran valor informatiu indicadores de processos tumorals, degut a la metodologia que s’usa per aïllar el secretoma, també s’acumulen gran quantitat de proteïnes contaminants. Tot i que el secretoma és un sub-proteoma amb clares implicacions com a eina diagnòstica per al càncer, fins ara hi havia dos problemes metodològics que limitaven l’eficàcia del seu ús. El primer és que el secretoma generat per les cèl•lules tumorals no hauria de tenir una contribució important de mort cel•lular. El segon és que hauríem de ser capaços de diferenciar les proteïnes secretades de les proteïnes del medi, atès que el medi en què creixen les cèl•lules també té proteïnes.
Aquest problema ha estat resolt en el vostre estudi?
Josep Villanueva: En el nostre estudi, el primer que determinem és com identificar les proteïnes trobades al secretoma que mesuren aquests processos de mort cel•lular, que són les que poden produir més interferències. Després seguim amb aquelles proteïnes fruit de la contaminació d’aquest secretoma a causa de les pròpies proteïnes que es troben en el sèrum que s’usa per el cultiu de les cèl•lules tumorals i hem descartat els artefactes coneguts fins arribar i aïllar al veritable secretoma generat per les cèl•lules tumorals.
Com heu evitat aquests artefactes, en l’estudi?
Josep Villanueva: En el treball que hem publicat recentment hem solucionat aquests dos problemes mitjançant estudis cinètics de secreció de proteïnes, marcatge de cèl•lules amb isòtops estables (no radioactius) i l’ús de l’espectrometria de masses.
I … Heu aconseguit identificar proteïnes més enllà d’aquests “contaminants”?
Josep Villanueva: Efectivament. En solucionar els principals problemes metodològics per a l’estudi dels secretomas, ens hem trobat que, aproximadament la meitat de les proteïnes secretades per cèl•lules tumorals no són secretades per la via clàssica, és a dir, mitjançant un pèptid senyal. Aquest grup de proteïnes té una localització teòrica en l’interior de la cèl lula, per exemple, al nucli, mitocondri, citoplasma, … i moltes d’elles mai s’havien trobat d’una manera específica fora de la cèl•lula.
Llavors és la primera vegada que es confirmen aquestes troballes?
Josep Villanueva: Sí, mai s’havia disseccionat d’una manera global el secretoma estudiant les diferentss vies de secreció. Hi ha hagut grups de recerca que han descobert que una proteïna concreta secretava per vies alternatives però nosaltres hem demostrat que aquest fenomen està molt estès. La presència de tantes proteïnes secretades per vies alternatives, que no s’esperava trobar d’una manera específica en l’espai extracel•lular, obre possibilitats inesperades, com que algunes d’aquestes proteïnes tenen funcions diferents en els diferents compartiments cel•lulars en què es troben.
Comentes que un gran nombre de proteïnes són secretades per vies alternatives. Com es secreten les proteïnes normalment?
Josep Villanueva: Les proteïnes secretades per la via clàssica ho fan mitjançant la via del Reticle Endoplasmàtic i l’aparell de Golgi, utilitzant el pèptid senyal. Entre les vies alternatives tenim els exosomes i les microvesícules. Altres proteïnes secreten els seus dominis extracel•lulars per processos de shedding, és a dir, que una proteasa talla específicament una part de la proteïna que queda fora de la cèl•lula, mentre que una altra part roman dins. A més, és important ressaltar que encara hi ha vies de secreció alternativa que no es coneixen.
El que hem trobat és que aproximadament la meitat de les proteïnes secretades per cèl•lules tumorals no són secretades per la via clàssica, és a dir, mitjançant un pèptid senyal, sinó per aquestes vies no clàssiques o alternatives. Aquesta secreció alternativa, precisament, no actua com a resposta a allò que és “esperable” sinó com a traducció d’un procés anòmal, d’aquí el seu valor informatiu sobre el procés patològic. Es tracta de proteïnes la localització de les quals no hauria de ser extracel•lular, però davant d’un procés tumoral ho és i aquest és el seu valor afegit com a candidates a biomarcadors tumorals.
I, metodològicament, és molt complex l’estudi proteòmic del secretoma?
Josep Villanueva: Té una elevada complexitat. Les tècniques proteòmiques tenen cada dia més importància. Això fa que avui siguin possibles troballes que ahir no ho eren i que puguem dissenyar estudis que avui no són viables però demà ho seran. La proteòmica presenta limitacions enfront d’altres disciplines, com ara la genòmica. La mateixa determinació de què és el que és mesurable forma part de la primera tasca a dur a terme ja que, a diferència d’altres tècniques, en la proteòmica no existeixen encara estàndards determinats per les pròpies marques comercials dels productes i tecnologies usades.
No hi ha referències tan bones com existeixen en genòmica i en estudis de l’expressió gènica. I davant de qualsevol estudi, la primera part sempre consisteix a mesurar què anem a mesurar. En altres disciplines ja hi ha uns paràmetres establerts prèviament amb els que poder comparar els teus resultats
Des del punt de vista metodològic, què suposa aquest estudi?
Josep Villanueva: Aquest estudi, a part dels propis resultats que hem trobat, ha establert els marges metodològics d’estudi del secretoma. La secreció de proteïnes, segons els nostres experiments, té la particularitat que depèn del temps. Les troballes del nostre treball han determinant els temps òptims per a la recollida del secretoma, balanç entre temps necessari per a l’adequada secreció de proteïnes abans de l’aparició de contaminants procedents de la mort cel•lular o de la privació de sèrum (font d’aliment per a la cèl • lula ), ja que les cèl•lules es sotmeten a rentats per evitar interferències amb les pròpies proteïnes del sèrum.
Part de la nostra investigació ha validat prèviament els grups de proteïnes procedents de situacions de mort i estrès cel lular i, també ha identificat quines proteïnes podrien ser considerades vàlides per el control de qualitat de línies cel•lulars de càncer de mama per a posteriors treballs i anàlisi de secretoma.
I des del punt de vista de la recerca del càncer?
Josep Villanueva: Bé, una vegada que vam demostrar que tantes proteïnes es secreten per vies alternatives, vam fer una validació funcional de la nostra troballa “in vivo”. Vam seleccionar un grup de proteïnes del nostre secretoma, que en realitat esperavem que estiguessin en el nucli, i vam mirar la seva localització en teixit humà de mama. Sorprenentment per nosaltres, vam veure que mentre que en teixit normal aquestes proteïnes són nuclears, en teixit tumoral canvien la seva localització i aquesta nova localització seria compatible amb el fet que se secretin. Per tant aquest estudi posa de manifest que un gran nombre de proteïnes que mai s’havien trobat en l’espai extracel•lular, són secretades específicament i podrien usar-se com a marcadors tumorals.
Finalment, plantegem la hipòtesi de què les cèl•lules tumorals utilitzen la secreció no convencional o alternativa de proteïnes durant la formació d’un tumor o fins i tot podria ser un mecanisme utilitzat per les cèl•lules tumorals durant la tumorogènesi.
I ara que metodològicament heu aconseguit solucionar limitacions d’estudi del secretoma, ¿esteu treballant en biomarcadors concrets?
Josep Villanueva: Al marge d’aquest treball a Molecular & Cellular Proteomics estem treballant en la caracterització de proteïnes que les cèl•lules de càncer colorectal utilitzen per a comunicar-se quan s’estimula una via anomenada EGFR o quan aquesta via es bloqueja amb nous fàrmacs anti-EGFR. Aquest projecte el realitzem dins d’un projecte FP7 de la Unió Europea en col•laboració amb diversos grups internacionals i, localment, amb el Dr. Josep Tabernero, Director del VHIO. L’objectiu d’aquest projecte és desenvolupar nous biomarcadors de resposta a aquests fàrmacs i també conèixer els mecanismes de resistència que cal evitar. També estem implementant algoritmes que milloren els resultats obtinguts gràcies a la proteòmica quantitativa i que, al mateix temps, ajudaran a descobrir altres biomarcadors tumorals.
Esperem poder compartir els resultats pròximament
